胃癌（GC）是全球第五大常見癌癥原因，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。這些高死亡率主要?dú)w因于大多數(shù)GC患者是在疾病相對晚期時被診斷出來的。事實(shí)上，在腫瘤仍符合手術(shù)切除條件的情況下檢測早期GC（EGC）可以將患者的生存率提高到70%，而晚期GC 患者的生存率則相對慘淡，僅為20%。在中國和其他GC發(fā)生率高的國家，常規(guī)的大規(guī)模篩查目前依賴于內(nèi)窺鏡檢查。然而，這種篩查經(jīng)常因患者依從性差和潛在并發(fā)癥的風(fēng)險而受到批評，提示了需要開發(fā)替代生物標(biāo)志物以早期發(fā)現(xiàn)這種GC的必要性。

      許多研究強(qiáng)調(diào)了循環(huán)細(xì)胞外囊泡（EV）中高濃度長鏈非編碼RNA（LR）的潛在臨床意義，并且已將幾種EV衍生的LR候選藥物確定為潛在的診斷生物標(biāo)志物。EV的LR圖譜與組織和循環(huán)細(xì)胞的圖譜不同，其提供了不同的生物學(xué)意義。先前的研究表明，lncRNA GClnc1具有功能致癌作用，能夠促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。由于LR在組織、血液、糞便和其他體液中的表達(dá)通常穩(wěn)定，因此它們已成為開發(fā)人類癌癥液體活檢生物標(biāo)志物的有希望的標(biāo)的。

方法學(xué)

      本研究納入了2141名患者，包括888名GC患者、158名慢性萎縮性胃炎患者、193名腸上皮化生患者、501名健康供體和401名其他胃腸道癌癥患者。在發(fā)現(xiàn)階段使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了I期GC組織樣品的LR譜。細(xì)胞外囊泡（EV）衍生的LR特征通過訓(xùn)練隊(duì)列（n = 554）進(jìn)行鑒定，并通過2個外部隊(duì)列（n = 429 和 n = 504）和補(bǔ)充隊(duì)列 （n = 69）進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié)論

      在發(fā)現(xiàn)階段，發(fā)現(xiàn)一個LR（GClnc1）在組織和循環(huán)EV樣本中均上調(diào)，早期GC（I/II 期）的曲線下面積（AUC）為 0.9369（95% 置信區(qū)間 [CI]，0.9073–0.9664）。該生物標(biāo)志物的診斷性能在2個外部隊(duì)列中進(jìn)行了驗(yàn)證（西安隊(duì)列，AUC：0.8839;95%CI：0.8336–0.9342;北京隊(duì)列，AUC：0.9018;95% CI：0.8597–0.9439）。此外，EV 衍生的 GClnc1 可有效區(qū)分早期 GC 與癌前病變（慢性萎縮性胃炎和腸上皮化生）以及傳統(tǒng)胃腸道生物標(biāo)志物（CEA、CA72-4 和 CA19-9）陰性的GC。該生物標(biāo)志物在術(shù)后和其他胃腸道腫瘤血漿樣本中的低水平表達(dá)表明其具有對GC的特異性。

結(jié)果 1

全基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析確定了用于檢測EGC患者的特征LR

      本研究的第一個目標(biāo)是確定用于檢測EGC系統(tǒng)和全面的LR特征。為此，使用來自美國癌癥聯(lián)合委員會 I 期 GC 患者的組織樣本（n = 10 對）。每個樣本都檢測了近 14,000 個注釋基因，包括信使RNA、LR 和假基因。檢測到的RNA種類數(shù)量在腫瘤和正常粘膜樣本之間沒有顯著差異（下圖A）。三維數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖表明，腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜通常與正常粘膜樣本的轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜不同（下圖B）。與使用 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)的正常粘膜樣本相比，總共鑒定出2個LR在腫瘤樣本中表達(dá)有差異。差異表達(dá)的LR與癌癥相關(guān)的一些通路有關(guān)，例如胃癌通路、mTOR信號通路和P2信號通路（下圖D）。

      為了提高已發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的整體特異性，將5個最優(yōu)的LR候選者與6個公共分析數(shù)據(jù)集（GSE26595、GSE33743、GSE23739、GSE70880、GSE28700 和 GSE93147）進(jìn)一步比對，隨后鑒定了3 個 LR（GClnc1、GCMA 和 MT1JP），它們代表了EGC患者中上調(diào)的標(biāo)志物。最后，多變量logistic回歸模型展現(xiàn)了此3-LR panel在EGC患者中的性能，其診斷AUC值為0.9257（95%置信區(qū)間[CI]，0.9011–0.9502;P < 0.0001），對患者EGC檢測的敏感性為86.31%，特異性為83.52%（圖2F）。這些結(jié)果表明，這種 3-LR panel 具有作為檢測 EGC 的生物標(biāo)志物的潛力。

結(jié)果 2

在獨(dú)立隊(duì)列中，建立和驗(yàn)證LR panel 在EGC患者中的診斷性能

      首先本文研究了在發(fā)現(xiàn)階段鑒定的基于組織的標(biāo)記是否可以在無細(xì)胞血漿中檢測到。令人失望的是，GC血漿樣本中的3個LR候選者與HD樣本沒有顯著差異，并且顯示出與HD一樣低的水平。

      循環(huán)游離lncRNA GClnc1主要封裝在EV內(nèi)，在分析EV耗盡的血漿時，這種lncRNA的水平顯著降低（P<0.0001）。此外，EV衍生的lncRNA GClnc1與lncRNA GClnc1的總循環(huán)游離水平顯著相關(guān)（r=0.7246;P < 0.0001）。這些結(jié)果有力地證明了這種基于組織的標(biāo)記物lncRNA GClnc1可以在具有EV封裝形式的血漿樣品中檢測到。

      接下來，為了確定EV衍生的lncRNA GClnc1對EGC的診斷潛力，使用qPCR檢查了其在1個獨(dú)立臨床隊(duì)列中從血漿樣本獲得的性能。該生物標(biāo)志物在一組患者（112 名 EGC 和 159 名 HD）中進(jìn)行了訓(xùn)練。與HD相比，EGC患者樣本中EV衍生的lncRNA GClnc1和3種測試的胃腸道腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物（CEA、CA72-4和CA19-9）水平均顯著升高（P<0.05;下圖A–D）。然而，EV 衍生的 lncRNA GClnc1 在 EGC 患者中表現(xiàn)出出色的診斷性能，AUC 值為 0.9369 （95% CI， 0.9073–0.9664;P < 0.0001），相應(yīng)的靈敏度為87.42%，特異度為84.82%，顯著高于CEA（AUC，0.6831;靈敏度，83.65%;特異性，49.11%），CA72-4（AUC，0.6204;靈敏度，74.84%;特異性，50.00%）和CA19-9（AUC，0.6066;敏感性，59.12%;特異性，58.04%;下圖E-H）。

      由于EV衍生的lncRNA GClnc1在訓(xùn)練隊(duì)列中檢測EGC的結(jié)果令人鼓舞，后續(xù)在西安（142個EGC和93個HD）和北京（108個EGC和108個HD）的2個外部獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列中進(jìn)一步評估了該生物標(biāo)志物的穩(wěn)健性和準(zhǔn)確性。西安隊(duì)列的敏感性為 89.81%，特異性為 78.49%，AUC 值為 0.9018（95% CI，0.8597–0.9439;P < 0.0001），北京隊(duì)列的敏感性為 89.44%，特異性為 80.56%。3 種傳統(tǒng)胃腸道生物標(biāo)志物在兩個外部驗(yàn)證隊(duì)列中顯示出較低的 AUC值、敏感性和特異性。

結(jié)果 3

lncRNA GClnc1 可靠地區(qū)分EGC和癌前病變

      眾所周知，有效生物標(biāo)志物的一個重要特征是可以區(qū)分早期癌癥和癌前病變。因此，本文研究了EV衍生的lncRNA GClnc1是否可以區(qū)分EGC和胃癌前病變（慢性萎縮性胃炎[CAG]和腸化生[IM]）。令人興奮的是，在西安驗(yàn)證隊(duì)列中，該生物標(biāo)志物在區(qū)分EGC與CAG和IM時保持了出色的診斷性能，AUC值為0.8523 (95% CI, 0.7921–0.9126; 敏感性, 85.19%; 特異性, 73.12%) 和0.8401 (95% CI, 0.7718–0.9084; 敏感性, 85.71%; 特異性, 74.19%)。同樣的，在北京驗(yàn)證隊(duì)列中，該生物標(biāo)志物則顯示出更好的診斷性能，AUC值為0.8702 (95% CI, 0.8131–0.9274; 敏感性, 86.49%; 特異性, 79.63%) 和 0.8510 (95% CI, 0.7907–0.9113; 敏感性, 84.38%; 特異性, 80.56%)。相比之下，傳統(tǒng)的胃腸道生物標(biāo)志物 CEA、CA4-72 和 CA4-19 在兩個外部驗(yàn)證隊(duì)列中都未能達(dá)到令人滿意的敏感性和特異性以區(qū)分 EGC 和癌前病變。

結(jié)果 4

lncRNA GClnc1 可識別早期（I/II 期）和晚期（III/IV 期）GC患者

      改善GC患者預(yù)后的一個重要方法是獲得早期診斷。本文已經(jīng)確定了EGC的診斷價值，進(jìn)一步驗(yàn)證這種生物標(biāo)志物是否可以應(yīng)用于晚期GC（AGC;III/IV期）。在西安驗(yàn)證隊(duì)列中，基于lncRNA GClnc1在EGC與AGC中的相對分布，該生物標(biāo)志物成功地識別了EGC和 AGC 患者。此外，該生物標(biāo)志物在檢測AGC方面顯示出優(yōu)異的診斷性能，AUC值為0.8910 (95% CI, 0.8500–0.9320; 敏感性, 85.78%; 特異性, 83.21%)，優(yōu)于其他3種胃腸道腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物（CEA：AUC，0.8060;敏感性，77.29%;特異性，76.34%;CA72-4：AUC，0.7012;靈敏度，82.61%;特異性，59.54%;CA19-9：AUC，0.6926;靈敏度，71.98%;特異性，56.49%;下圖5A-D）。同時，在北京驗(yàn)證隊(duì)列中，該生物標(biāo)志物在檢測AGC方面也保持了優(yōu)異的診斷性能，AUC為0.8978（95%CI，0.8642-0.9314;靈敏度，90.53%;特異性，76.47%），優(yōu)于CEA（AUC，0.6616;靈敏度，76.54%;特異性，48.37%），CA72-4（AUC，0.6642;靈敏度，79.01%;特異性，51.63%）和CA19-9（AUC， 0.5823;靈敏度，65.43%;特異性，48.37%;下圖E- H）。2個外部驗(yàn)證隊(duì)列的校準(zhǔn)曲線保持穩(wěn)定。

結(jié)果 5

lncRNA GClnc1 能有效識別傳統(tǒng)胃腸道腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物陰性的GC患者

      據(jù)報(bào)道，20%-40%的GC患者傳統(tǒng)胃腸道生物標(biāo)志物（包括 CEA、CA72-4 和CA19-9）陰性，生物標(biāo)志物有必要識別這個亞組的GC患者。對于西安驗(yàn)證隊(duì)列中胃腸道生物標(biāo)志物陰性的GC患者，EV衍生的lncRNA GClnc1在區(qū)分這些腫瘤與癌前病變和HD樣本時顯示出很高的診斷效率（下圖11 A-11 D)。與這些結(jié)果一致，在北京驗(yàn)證隊(duì)列中，該生物標(biāo)志物在識別胃腸道生物標(biāo)志物陰性患者方面同樣保持了出色的診斷性能（下圖11 E-11 H）。此外，2 個外部驗(yàn)證隊(duì)列的校準(zhǔn)曲線仍然保持穩(wěn)定?？傊?，這些結(jié)果揭示了 EV 衍生的 lncRNA GClnc1 在識別胃腸道生物標(biāo)志物陰性的 GC 患者亞組方面具有穩(wěn)健性。

參考文獻(xiàn)

Guo X, Peng Y, Song Q, Wei J, Wang X, Ru Y, Xu S, Cheng X, Li X, Wu D, Chen L, Wei B, Lv X, Ji G. A Liquid Biopsy Signature for the Early Detection of Gastric Cancer in Patients. Gastroenterology. 2023 Aug;165(2):402-413.e13. doi: 10.1053/j.gastro.2023.02.044. Epub 2023 Mar 7. PMID: 36894035.