化妝品中他克莫司和吡美莫司的測定 （BJH 202301）

　　1 范圍
　　本方法規(guī)定了化妝品中他克莫司和吡美莫司的測定方法。
　　本方法適用于膏霜乳類、液體（水、油）類化妝品中他克莫司和吡美莫司的定性和定量測定。

　　2 方法提要
　　樣品經甲醇超聲提取后，采用高效液相色譜儀分離，質譜檢測器檢測。根據保留時間和特征離子對豐度比定性，待測組分相對應離子峰面積定量，以標準曲線法計算含量。

　　3 試劑與材料
　　除另有規(guī)定外，本方法中所用試劑均為分析純及以上規(guī)格，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

　　3.1 甲醇，色譜純。
　　3.2 乙酸銨，色譜純。
　　3.3 乙酸，色譜純。
　　3.4 含0.1%乙酸-5mmol/L乙酸銨的水溶液：準確稱取0.3854g乙酸銨（3.2），加入1.0mL乙酸（3.3），用水溶解并稀釋至1000mL，混勻。
　　3.5 含0.1%乙酸-5mmol/L乙酸銨的甲醇溶液：準確稱取0.3854g乙酸銨（3.2），加入1.0mL乙酸（3.3），用甲醇（3.1）溶解并稀釋至1000mL，混勻。
　　3.6 標準品：他克莫司、吡美莫司的標準品純度均≥95.0%，標準品的中文名稱、英文名稱、CAS號、分子式、相對分子質量、結構式見附錄A中的表A.1。
　　3.7 標準儲備溶液：稱取他克莫司、吡美莫司標準品各10mg（精確到0.00001g），分別置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并定容至刻度，混勻。制成標準儲備溶液的質量濃度均為1000mg/L。置于-18℃冰箱中保存。
　　3.8 混合標準儲備溶液：準確移取他克莫司、吡美莫司標準儲備溶液（3.7）0.1mL置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1）稀釋至刻度，搖勻。制成濃度為10mg/L的混合標準儲備溶液。置于-18℃冰箱中保存。

　　4 儀器與設備

　　4.1 高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀。
　　4.2 分析天平：感量0.0001g和0.00001g。
　　4.3 超聲波清洗器。
　　4.4 渦旋混合儀。
　　4.5 高速離心機。

　　5 試樣制備與保存
　　樣品應按照標簽標示的貯存條件進行保存。取樣前，應檢查封口的完整性，觀察樣品的性狀和特征，并使樣品混勻。打開包裝后，應盡可能快地取出所要測定部分進行分析，取樣后，應將樣品進行密封保存。

　　6 分析步驟
　　6.1 篩查用混合標準溶液
　　取混合標準儲備溶液（3.8）適量，用甲醇（3.1）進行稀釋，配制成他克莫司、吡美莫司濃度為1.0μg/L的篩查用混合標準溶液。
　　6.2 空白基質提取液
　　稱取空白試樣0.2g（精確到0.0001g），置于10mL具塞比色管中，自“加入8mL甲醇”起與樣品同法處理（6.5），作為空白基質提取液。
　　6.3 基質混合標準中間溶液
　　準確量取混合標準儲備溶液（3.8）0.1mL置于10mL容量瓶中，用空白基質提取液（6.2）稀釋至刻度，搖勻，制成他克莫司、吡美莫司濃度為100μg/L的基質混合標準中間溶液。
　　6.4 基質混合標準系列溶液
　　分別精密量取基質混合標準中間溶液（6.3）適量，用空白基質提取液（6.2）配制濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、20、50μg/L的基質混合標準系列溶液?；|混合標準系列溶液應現用現配。
　　6.5 樣品處理
　　稱取混合均勻的試樣約0.2g（精確至0.0001g）于10mL具塞比色管中，加入8mL甲醇（3.1），于渦旋混合儀上振蕩30s至試樣與提取溶劑混合均勻。超聲提取15min，靜置至室溫，然后用甲醇（3.1）定容至刻度，搖勻，以4000 r/min離心5min，上清液經0.22 μm濾膜濾過，濾液作為供試品溶液備用（供試品溶液可根據實際濃度進行適當稀釋）。
　　6.6 儀器參考條件
　　6.6.1 色譜條件
　　色譜柱：C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm），或等效色譜柱；流動相：A為含0.1%乙酸-5mmol/L乙酸銨的水溶液，B為含0.1%乙酸-5mmol/L乙酸銨的甲醇溶液。梯度洗脫程序見表1。
　　流速：0.3mL/min；
　　柱溫：45℃；
　　進樣量：2μL。

　　6.6.2 質譜條件
　　離子源：電噴霧離子源（ESI源）；
　　監(jiān)測模式：正離子多反應監(jiān)測模式（MRM），監(jiān)測離子對及相關參數設定見表2。

　　“*”為推薦的定量離子。
　　注：當采用不同質譜儀器時，儀器參數可能存在差異，測定前應將質譜參數優(yōu)化到最佳。
　　6.7 定性判定
　　取供試品溶液（6.5）與篩查用混合標準溶液（6.1）在相同分析條件下測定，樣品中如呈現定量離子對和定性離子對的色譜峰，被測成分的特征離子峰保留時間與篩查用混合標準溶液（6.1）對應的保留時間一致，且選擇的監(jiān)測離子對的相對豐度比與相當濃度的篩查用混合標準溶液（6.1）的監(jiān)測離子對的相對豐度比的最大偏差不超過表 3 的規(guī)定，則可以判定樣品中存在對應的組分。

　　6.8 定量測定
　　取基質混合標準系列溶液（6.4）依次測定，以待測組分的系列濃度為橫坐標，待測組分的峰面積為縱坐標，進行線性回歸，繪制基質標準曲線，其線性相關系數應大于0.99。
　　取供試品溶液（6.5）測定，將對應的定量離子對色譜峰面積代入基質標準曲線。按“7”項下公式，計算樣品中待測組分的含量。
　　6.9 平行試驗
　　按以上步驟，對同一樣品進行平行實驗測定。
　　6.10 空白試驗
　　除不加試樣外，均按上述測定條件和步驟進行。

　　7 結果計算

　　結果按式（1）計算：

　　式中：
　　ω―樣品中他克莫司、吡美莫司的質量分數，mg/kg；ρ―供試品溶液中他克莫司、吡美莫司的質量濃度，μg/L；V―樣品定容體積，mL；
　　m―樣品取樣量，g；
　　D―稀釋倍數（如未稀釋則為1）。
　　在相同條件下獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

　　8 精密度與準確度
　　多家實驗室驗證回收率為80%～120%，相對標準偏差小于10%（n=6）。

　　9 檢出限和定量限
　　本方法中他克莫司、吡美莫司的檢出限、定量下限及取樣量為0.2g時的檢出濃度、最低定量濃度見表4。

　　10 圖譜

　　附錄A
　　他克莫司、吡美莫司的相關信息
　　表A.1 他克莫司、吡美莫司的中文名稱、英文名稱、CAS號、分子式、相對分子質量及結構式

       起草單位：山東省食品藥品檢驗研究院
　　主要起草人：李啟艷、王維劍、牛水蛟、于海英

       驗證單位：中國食品藥品檢定研究院、上海市食品藥品檢驗研究院、深圳市藥品檢驗研究院

       編 發(fā)：北京天健華成 化妝品注冊部

源：國家藥監(jiān)局 申報大廳